前言
本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1和GB/T 20001.4給出的規(guī)則起草。
本標(biāo)準(zhǔn)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由中國畜產(chǎn)品加工研究會(huì)歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、上海雄圖生物科技有限公司、無錫雄圖食品安全檢測有限公司。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王瑋、汪勁能、王艷、沈娟、譚祈峻、蔣燊。
本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。
使用本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)征得發(fā)布單位同意。
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了時(shí)間分辨熒光免疫分析法快速檢測豬肉中氯丙嗪殘留量的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肉中氯丙嗪殘留量的現(xiàn)場快速篩查測定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
GB/T 20763 豬腎和肌肉組織中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
NY/T 1897 動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范
3 原理
試樣中氯丙嗪與銪離子熒光微球標(biāo)記的氯丙嗪抗體結(jié)合后，抑制了層析過程中抗體與硝酸纖維膜檢測線上氯丙嗪-牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物的免疫反應(yīng)，使檢測線上熒光微球發(fā)出的時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度降低，通過檢測時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行定量測定。
4 試劑和材料
以下所有試劑，均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。
4.1 乙腈（CH3CN）。
4.2 甲醇（CH3OH）。
4.3 氫氧化鈉（NaOH）。
4.4 正己烷（C6H14）。
4.5 十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。
4.6 二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）。
4.7 氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取4.00g氫氧化鈉，用水溶解并定容至100mL。
4.8 磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH7.2）：稱取12.90g十二水合磷酸氫二鈉和2.18g二水合磷酸二氫鈉，用水溶解并定容至1L。
4.9 氯丙嗪時(shí)間分辨熒光免疫定量試劑盒，2℃～8℃保存。
4.9.1 氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥98%。
4.9.2 氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取適量的氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。
4.9.3 氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液將氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制成濃度分別為0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
4.9.4 氯丙嗪時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測卡：固定有氯丙嗪-BSA偶聯(lián)物，用于樣品中氯丙嗪與銪離子熒光微球標(biāo)記抗體預(yù)反應(yīng)后再與氯丙嗪-BSA偶聯(lián)物反應(yīng)的載體。
5 儀器和設(shè)備
5.1 時(shí)間分辨熒光檢測儀（配LED激發(fā)光源）。
5.2 恒溫孵育器：室溫～100℃，控溫精度±0.1℃。
5.3 電子天平：感量0.01g。
5.4 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。
5.5 組織搗碎機(jī)。
5.6 氮?dú)獯蹈裳b置。
5.7 移液器：單道200μL，1000μL。
5.8 漩渦混合器。
5.9 離心管：10mL，50mL。
6 試樣制備
取新鮮或解凍的豬肉樣品約500 g，剔除筋膜，用組織搗碎機(jī)充分搗碎均勻，裝入潔凈容器中，密封，并加以標(biāo)識(shí)，于-18℃以下冷凍存放。
7 樣本提取
7.1 稱取5g試樣（精確到0.01g）于50mL離心管中，加入乙腈10mL，振蕩混合5min，4000r/min離心5min。
7.2 移取上清液（7.1）8 mL于50mL離心管中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2mL，再加正己烷5mL，振蕩混合2min，4000r/min離心2min。
7.3 移取上清液（7.2）3mL于10mL試管中，于60℃水浴下氮?dú)獯蹈?，?.05 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL，充分混合，取100μL用于分析。
8 測定步驟
8.1 氯丙嗪時(shí)間分辨熒光免疫定量試劑盒和所需試劑的溫度均應(yīng)回升至常溫后方可使用，注意每種液體使用前均需搖勻。
8.2 打開時(shí)間分辨熒光檢測儀和恒溫孵育器電源開關(guān)，開機(jī)預(yù)熱10min。
8.3 將氯丙嗪時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測卡水平放置于恒溫孵育器加熱板上，加系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（4.9.3）或試樣液（7.3）100μL到對(duì)應(yīng)的檢測卡加樣孔中，蓋上恒溫孵育器蓋后于37℃恒溫保持6min。
8.4 恒溫結(jié)束后，取出氯丙嗪時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測卡，在激發(fā)波長365nm，檢測波長610nm條件下上機(jī)檢測。
9 平行試驗(yàn)
按以上步驟，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液、同一樣品溶液均進(jìn)行平行試驗(yàn)測定。
10 空白試驗(yàn)
除不稱取試樣外，均按上述步驟進(jìn)行。
11 監(jiān)控試驗(yàn)
每次測定均應(yīng)做一個(gè)添加氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)的空白樣品。
12 結(jié)果計(jì)算
將6個(gè)濃度的氯丙嗪的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）和待測溶液按測定步驟（8）測定相應(yīng)的時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度值。根據(jù)檢測線T信號(hào)值與質(zhì)控線C信號(hào)值的比值（T/C）和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的自然對(duì)數(shù)值（lnc）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該定標(biāo)模型在0.1ng/mL～10ng/mL范圍內(nèi)是線性的。在標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得待測溶液中氯丙嗪含量。
試樣中氯丙嗪含量X，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/kg）表示，按式（1）計(jì)算。
（1） 式中：
ρ——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的待測溶液中氯丙嗪含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V——試樣提取溶液體積，單位為毫升（mL）；
n——試樣稀釋倍數(shù)；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。
13 確證試驗(yàn)
如被測樣品中氯丙嗪殘留量的值大于檢出限時(shí)，應(yīng)用GB/T 20763中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法進(jìn)行確證。
14 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
14.1 靈敏度
本方法在豬肉樣品中的檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.24μg/kg。
14.2 準(zhǔn)確度
本方法在0.25μg/kg～10μg/kg添加濃度水平的回收率為80%～120%。
14.3 精密度
本方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%。
本標(biāo)準(zhǔn)由中國畜產(chǎn)品加工研究會(huì)于2021年2月3日發(fā)布，2021年2月3日實(shí)施。
