摘要:以豬背最長(zhǎng)肌為原料,研究超高壓(100~600MPa)結(jié)合熱處理(25~55℃)條件下,蛋白質(zhì)相互作用力的變化,豬肉主要組成部分肌原纖維蛋白氧化程度,表面疏水性及結(jié)構(gòu)變化,并建立他們之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明:超高壓結(jié)合熱處理后穩(wěn)定豬肉蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵。經(jīng)超高壓結(jié)合熱處理的肌原纖維蛋白質(zhì)巰基含量極顯著下降(p<0.01),二硫鍵含量、疏水性和羰基值極顯著上升(p<0.01)。二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,螺旋結(jié)構(gòu)減少,無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。相關(guān)性分析結(jié)果表明超高壓結(jié)合熱處理與蛋白質(zhì)相互作用力、蛋白質(zhì)羰基值、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間存在著極顯著的相關(guān)關(guān)系(p<0.01)。這些結(jié)果可以幫助我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化,科學(xué)指導(dǎo)其生產(chǎn)過(guò)程,為開(kāi)發(fā)新型肉制品提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞:超高壓;熱處理;蛋白質(zhì)相互作用力;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);相關(guān)分析
食品超高壓技術(shù)能在不影響肉類(lèi)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分的前提下改善肉類(lèi)嫩度,延長(zhǎng)貨架期,同時(shí)保持原有的色、香、味、形,但同時(shí)超高壓處理也能促進(jìn)肉中脂肪氧化,這也限制了其在肉制品中的應(yīng)用。大量研究表明,對(duì)僵直前期的肌肉進(jìn)行壓力處理能取得較好的嫩化效果,而僵直后肌肉則需與一定的熱處理相結(jié)合。因此,高壓技術(shù)在肉類(lèi)加工中的應(yīng)用正朝著與熱結(jié)合處理的方向發(fā)展。我國(guó)超高壓技術(shù)的研究明顯落后于發(fā)達(dá)國(guó)家,尤其是日本、美國(guó)和韓國(guó)等,迫切需要加快開(kāi)展超高壓食品的研究。
蛋白質(zhì)是肉制品的主要組成部分之一,肌原纖維蛋白約占總蛋白的40%~60%,不但在肌肉收縮中很重要,而且在肉類(lèi)加工中起關(guān)鍵作用,它與肉制品加熱過(guò)程中形成的粘結(jié)性和質(zhì)構(gòu)有關(guān),還賦予肌肉食品許多期望的物理化學(xué)特性,具有重要的生物學(xué)功能特性,對(duì)食品感官品質(zhì)具有重要的影響。超高壓結(jié)合熱處理會(huì)改變蛋白質(zhì)相互作用力及結(jié)構(gòu),使其功能特性發(fā)生變化,如蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠型及乳化活性等,從而影響實(shí)際生產(chǎn)中蛋白質(zhì)的加工特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。只有了解超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化機(jī)制,才能更好地在實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行規(guī)模化應(yīng)用。
近年來(lái),高壓對(duì)蛋白質(zhì)的影響逐漸成為食品工作者研究的熱點(diǎn),在高壓條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化是高壓技術(shù)在食品中應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前,相關(guān)研究主要集中在肌原纖維蛋白及其主要成分肌球蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠特性和單純高壓處理對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及凝膠特性的影響。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉蛋白質(zhì)相互作用力及結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。本研究以豬背最長(zhǎng)肌為原料,對(duì)其進(jìn)行超高壓(100~600MPa)結(jié)合熱(25~55℃)處理15min,利用不同溶劑對(duì)不同蛋白質(zhì)作用力的規(guī)避作用研究蛋白質(zhì)相互作用力的變化,評(píng)價(jià)豬肉主要組成部分肌原纖維蛋白氧化程度,跟蹤其表面疏水性及結(jié)構(gòu)的變化,并分析他們之間的相關(guān)性,以期全面認(rèn)識(shí)超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化,加快超高壓食品的研究,科學(xué)指導(dǎo)其生產(chǎn)過(guò)程,為開(kāi)發(fā)新型肉制品提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
白玉黑土豬 四川綿陽(yáng)天農(nóng)生態(tài)食品開(kāi)發(fā)有限公司提供,為同批飼養(yǎng),宰殺后冷卻,取背最長(zhǎng)肌約1kg,快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,剔除肉眼可見(jiàn)脂肪及結(jié)締組織等,按20g/份分裝于真空透明封裝袋中,于真空封裝機(jī)上真空包裝,-18℃保藏待用。原料肉使用前需在4℃下解凍24h。
苯甲基磺酰氟;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、EDTA、三氯乙酸(TCA)、氯化鈉、尿素、溴酚藍(lán)、乙酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸胍及其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。
HPP.L2-800/1型食品高壓設(shè)備;DZ400-DZ(2L)型真空封裝機(jī);FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī);UV1000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī) HITACHI;FT-IR5700 傅里葉變換紅外光譜儀。
1.2 超高壓結(jié)合熱處理
超高壓結(jié)合熱處理參數(shù)設(shè)置為:最高工作壓力為800MPa,升壓速度約50MPa/s,卸壓速度約100MPa/s。傳壓介質(zhì)為葵二酸二辛酯液壓油,將真空封裝且解凍后的樣品,對(duì)其進(jìn)行超高壓(100~600MPa)結(jié)合熱處理(25~55℃)15min。處理后備用。
1.3 豬肉蛋白質(zhì)分子相互作用力的測(cè)定
豬肉蛋白質(zhì)分子相互作用力的測(cè)定參照Visessanguan 等方法,并略加改進(jìn)。溶液包括:0.6mol/L KCl (S1);20mmol/L Tris,pH8.0 (S2);20mmol/LTris,pH8.0包含1% (m/V) SDS (S3);20mmol/L Tris,pH8.0包含1% (m/V) SDS 和8mol/L 尿素(S4);20mmol/L Tris,pH8.0包含1% (m/V) SDS,8mol/L 尿素和2% (V/V)β-巰基乙醇(S5);0.5 mol/L NaOH(S6)。2g絞碎樣品,分別加入20mL上述溶液,室溫下磁力攪拌4h,其S5攪拌前100℃水浴2min。樣品在離心機(jī)中以12100×g離心30min,將4mL上清液加入50% TCA使上清液最終TCA濃度達(dá)到10%,樣品在3℃冷藏18h,之后在離心機(jī)中以2500×g離心20min,沉淀用0.5mol/L NaOH 溶解,蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法測(cè)定。結(jié)果以各部分蛋白含量占S6的百分比表示。
1.4 豬肉肌原纖維蛋白的分離與檢測(cè)
采用Martinaud 等方法并略加改進(jìn)。10g絞碎樣品,加入10倍溶液(20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液,pH6.5,含50mmol/L NaCl,25mmol/L KCl,3 mmol/LMgCl2,4 mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF),用高速勻漿機(jī)在8000r/min 冰浴下均質(zhì)1min,勻漿過(guò)60目篩網(wǎng)去除基質(zhì)蛋白,濾過(guò)液在冷凍離心機(jī)中離心(2000×g,15min,4℃),沉淀部分用50mmol/L KCl(pH6.4)磷酸鹽緩沖液洗滌一次和去離子水洗滌兩次。得到沉淀即為肌原纖維蛋白。部分樣品冷凍干燥備紅外光譜檢測(cè)。
1.4.1 肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵含量的測(cè)定
參照Beveridge 等的Ellman 試劑分析方法略加改進(jìn)。加4mg DTNB 試劑于1mL的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,4 mmol/LEDTA,pH8.0)中,配成Ellman 試劑。將提取的肌原纖維蛋白加入5倍體積的緩沖溶液勻漿,取0.5mL勻漿液溶于2.5 mL的Tris-甘氨酸-8mol/L尿素緩沖液,漩渦震蕩,加入20μL Ellman 試劑,將懸濁液置于室溫(25℃±1℃)下保溫1h,10000×g離心15min,測(cè)定412nm處吸光值(A412),以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),280nm測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)含量。計(jì)算公式如下:
μmol SH/g=73.53A412/C
其中73.53=106/1.36×104,1.36×104為摩爾消光系數(shù),C 為樣品的蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。
測(cè)定總巰基含量時(shí),取0.2 mL勻漿液,加入2mLTris-甘氨酸-10mol/L尿素緩沖液,再加入0.02 mL β-巰基乙醇,室溫下反應(yīng)1h,之后加入50%TCA至最終濃度為10%,3000×g離心沉淀用12%TCA 洗滌兩次,將沉淀溶于3mL的Tris-甘氨酸-8mol/L 尿素緩沖液,二硫鍵含量為總巰基含量與游離巰基的差值。
1.4.2 肌原纖維蛋白羰基值的測(cè)定
蛋白質(zhì)的氧化采用羰基值表征。測(cè)定方法按照Oliver等方法。
1.4.3 肌原纖維蛋白表面疏水性的測(cè)定
肌原纖維蛋白用20mM的磷酸緩沖溶液分散,用雙縮脲法調(diào)整蛋白濃度為10mg/mL。表面疏水性測(cè)定采用Chelh等方法并略加改進(jìn),1mL懸濁液加入40μL 1mg/mL的溴酚藍(lán)溶液,渦旋振蕩混勻10min??瞻诪橛?0mM的磷酸緩沖溶液代替蛋白溶液。在離心機(jī)中以2000×g離心15 min,595nm測(cè)定吸光值。表面疏水性按下述公式計(jì)算:
BPB bound(μg)=40μL×(OD control-OD sample)/OD control
1.4.4 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定
采用傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)分析肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。準(zhǔn)確稱(chēng)量2mg的樣品,加入100mg溴化鉀,用研缽研磨成均勻粉末,壓制成薄片,再用紅外光譜儀做全波段掃描(400~4000 cm-1),掃描次數(shù)128次。數(shù)據(jù)處理采用PeakFit 4.12軟件,Omnic 軟件和Origin8.0軟件。
1.5 數(shù)據(jù)分析
每組試驗(yàn)重復(fù)4次,所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)給出,采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(p<0.01)。
2 結(jié)果與分析
2.1 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉蛋白質(zhì)相互作用力的影響
影響蛋白質(zhì)折疊的作用力主要可以分為兩類(lèi):蛋白質(zhì)分子固有作用力所形成的分子內(nèi)相互作用;受周?chē)軇┯绊懙姆肿觾?nèi)相互作用。范德華相互作用和空間相互作用屬于前者,而氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用屬于后者。在超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中,豬肉蛋白質(zhì)分子間相互作用力會(huì)發(fā)生改變,進(jìn)而影響其品質(zhì)和加工性能。
本研究采用五種不同的溶劑規(guī)避不同的蛋白質(zhì)作用力,氯化鉀規(guī)避靜電作用力,SDS規(guī)避氫鍵,尿素規(guī)避疏水作用力,巰基乙醇打破二硫鍵。圖1(a~e)顯示了豬肉經(jīng)超高壓(100~600 MPa)結(jié)合熱處理(25~55℃)后,蛋白質(zhì)在不同溶劑(S1~S5)中溶解度的變化,進(jìn)而反映出不同的蛋白質(zhì)分子相互作用力在超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中的變化規(guī)律,從而得出其對(duì)三維結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。
隨著處理壓力和溫度的升高,蛋白質(zhì)在S1中的溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì),主要是由于熱作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)降解所造成的蛋白質(zhì)部分損失。增加處理壓力,蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用被削弱,符合勒夏特列原理,即超高壓會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)的離子鍵斷裂。S2的變化規(guī)律與S1類(lèi)似,超高壓和熱處理會(huì)造成蛋白質(zhì)多肽鏈伸展和去折疊從而形成一些網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和聚集,影響蛋白質(zhì)在S2中的溶解度。在25℃下,隨著壓力的增大,蛋白質(zhì)在S3中的溶解度變化并不明顯。溫度進(jìn)一步升高到35℃,在不同的壓力處理?xiàng)l件下,溶解度略有下降。溫度繼續(xù)從35℃增加到55℃,常壓下溶解度明顯變化(從63.90%下降到55.93%),然后隨著壓力的上升,又逐步回升。原因可能在于,溫度從35℃增加到55℃,蛋白質(zhì)在熱作用下二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,氫鍵急劇減少;然而超高壓處理可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間的氫鍵,Le Tilly 等人對(duì)馬心肌肌紅蛋白進(jìn)行了紅外光譜分析,發(fā)現(xiàn)300MPa的壓力對(duì)分子內(nèi)部的氫鍵有穩(wěn)定作用。隨著壓力的升高,蛋白質(zhì)形成新的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),相應(yīng)的氫鍵作用力又緩慢回升。溫度從25℃升到35℃,常壓下蛋白質(zhì)在S4中的溶解度減小,溫度進(jìn)一步升高到55℃,溶解度達(dá)到最大值。然后隨壓力的增大而逐步回落。蛋白質(zhì)溶液系統(tǒng)中的熵增加是疏水作用的主要推動(dòng)力。從35℃到55℃,熱作用使得蛋白質(zhì)溶液變性展開(kāi),疏水基團(tuán)更加暴露,疏水相互作用力也快速升高。這時(shí)增加處理壓力,蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)逐步形成和加強(qiáng),疏水基團(tuán)被不斷固定,因此疏水相互作用力穩(wěn)步下降。Grigera 等人研究發(fā)現(xiàn),300MPa的壓力降低了脫輔基肌紅蛋白的疏水作用,引起該蛋白分子三維結(jié)構(gòu)的改變。蛋白質(zhì)在S5中的溶解度隨著壓力和溫度的升高而增大,55℃600MPa達(dá)到最大值。這是因?yàn)椋S著壓力和溫度的增加,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),暴露的巰基通過(guò)二硫鍵形成聚集。
綜上所述,超高壓結(jié)合熱處理后穩(wěn)定豬肉蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵。未處理豬肉在S1-S5溶劑中溶解度從大至小分別為S3>S4>S5>S2>S1,說(shuō)明此時(shí)靜電作用、氫鍵、疏水作用和二硫鍵均對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn),而超高壓結(jié)合熱處理后,改變了這幾種作用力的貢獻(xiàn)大小,使得溶解度大小變化為S5>S3>S4>S2>S1,表明在超高壓結(jié)合熱處理的過(guò)程中,蛋白質(zhì)降解會(huì)導(dǎo)致肉蛋白中巰基的暴露,加快二硫鍵的形成,而二硫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用。
2.2 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵的影響
圖1 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)蛋白質(zhì)相互作用力的影響
注:a~e分別代表不同溫度和壓力處理?xiàng)l件下,蛋白質(zhì)在溶劑S1~S5中的溶解性。
天然蛋白質(zhì)中包埋有許多疏水基團(tuán)和疏基,圖2為超高壓結(jié)合熱處理?xiàng)l件下豬肉肌原纖維蛋白疏基和二硫鍵含量的變化情況。從圖中可以看出,隨著壓力和溫度的上升,巰基含量極顯著下降(p<0.01),二硫鍵含量極顯著上升(p<0.01)。這表明超高壓和熱處理下巰基基團(tuán)暴露到分子表面,部分與空氣中的氧氣充分結(jié)合,形成二硫鍵,與2.1中超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中二硫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用結(jié)果一致。二硫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵,二硫鍵的生成可以降低蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)定從而達(dá)到良好的熱穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也更為致密,凝膠強(qiáng)度增加。因此,肉制品超高壓處理應(yīng)充分考慮壓力和溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。
2.3 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白疏水性的影響
肌原纖維蛋白質(zhì)屬于水不溶性蛋白,不能采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定,Chelh利用疏水性基團(tuán)與溴酚藍(lán)結(jié)合創(chuàng)建了肌原纖維蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定方法。疏水作用是維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)作用力之一,對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能性質(zhì)具有重要作用。蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是蛋白分子之間以及蛋白分子與溶劑水分子之間作用力平衡的結(jié)果。一定的疏水性對(duì)于蛋白凝膠的形成和產(chǎn)生穩(wěn)定的乳化物非常重要。
圖2 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)巰基和二硫鍵的影響
注:相同指標(biāo)標(biāo)注不同字母者具有極顯著性差異,p<0.01;a~d 分別代表25℃、35℃、45℃和55℃溫度處理?xiàng)l件下,巰基和二硫鍵含量對(duì)壓力增加的變化規(guī)律。
圖3 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白疏水性的影響
注:同一條曲線(xiàn)標(biāo)注不同字母者具有極顯著性差異,p<0.01。
從圖3可以看出,隨著壓力和溫度增加,豬肉肌原纖維蛋白疏水性逐漸增加,當(dāng)壓力大于200MPa時(shí),疏水性極顯著增大(p<0.01)。壓力會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白解折疊,從而使疏水殘基從蛋白質(zhì)內(nèi)部暴露出來(lái),同時(shí),壓力還會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表面特殊氨基酸殘基的出現(xiàn),導(dǎo)致疏水性增加。熱作用也會(huì)導(dǎo)致表面疏水性的極顯著增加(p<0.01)。Chelh 等研究結(jié)果表明肌原纖維蛋白的表面疏水性與加熱時(shí)間和溫度顯著相關(guān)。
2.4 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白氧化的影響
圖4 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白羰基值的影響
注:同一條曲線(xiàn)標(biāo)注不同字母具有極顯著性差異,p<0.01。
超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中豬肉肌原纖維蛋白羰基值的變化如圖4所示。隨著壓力和溫度的升高,羰基值極顯著增大(p<0.01),從25℃0.1 MPa時(shí)的1.432nmol/mg 蛋白增加到55℃600 MPa時(shí)的9.965nmol/mg 蛋白。Sato和Hegaryt認(rèn)為,任何能引起肉類(lèi)肌纖維膜系統(tǒng)破壞的處理過(guò)程,如絞碎、加熱、高壓等,都能導(dǎo)致易氧化的成分曝露于氧氣中,從而加速氧化過(guò)程。在高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及大部分肌漿蛋白變性,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,造成鐵及其它過(guò)渡金屬離子的釋放,一些亞鐵血紅素、過(guò)渡態(tài)的金屬離子和各種氧化酶可能會(huì)作為產(chǎn)生活性氧(ROS)和非氧自由基的催化劑或者作為前體物質(zhì)。這些自由基會(huì)攻擊蛋白質(zhì),對(duì)蛋白質(zhì)氧化起到很強(qiáng)的催化作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基值升高。Estévez 等研究發(fā)現(xiàn)在法蘭克福香腸冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)羰基值與脂質(zhì)氧化的羰基值顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.75(p<0.01)。豬肉在超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中脂質(zhì)氧化程度增加,這可能是造成蛋白質(zhì)氧化的原因之一。
2.5 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響
酞胺Ⅰ帶的特征吸收峰位于1700cm-1-1600cm-1,是由蛋白多肽骨架的C=O 伸縮振動(dòng)引起的,為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域,且其吸收最強(qiáng),常被用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。
超高壓結(jié)合熱處理后肌原纖維蛋白紅外光譜圖進(jìn)行基線(xiàn)校正和9點(diǎn)平滑后,發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶是由多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)重疊形成的寬峰,因此,需對(duì)各樣品的酰胺Ⅰ譜帶(1700~1600 cm-1)用軟件進(jìn)行求二階導(dǎo)數(shù)及去卷積,對(duì)得到的各子峰進(jìn)行確認(rèn),經(jīng)Peakfit 對(duì)曲線(xiàn)進(jìn)行擬合,多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的比率。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系為:1600~1640 cm-1 為β-折疊;1640~1650cm-1為無(wú)規(guī)卷曲;1650~1660 cm-1為α-螺旋;1660~1695cm-1 為β-轉(zhuǎn)角。
圖5 超高壓結(jié)合熱處理后豬肉肌原纖維蛋白紅外圖譜
超高壓結(jié)合熱處理?xiàng)l件下,豬肉肌原纖維蛋白紅外原始圖譜如圖5所示,由上到下依次為25~55℃。隨著處理壓力和溫度的增加,肌原纖維蛋白氨基酸殘基總吸光度發(fā)生了變化,峰形發(fā)生了不同程度的改變,說(shuō)明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。25℃下,隨著壓力的增大,酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1656 cm-1 移動(dòng)到1650cm-1;35℃下,增大壓力,酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1655cm-1 升高到1656 cm-1 最后又降低到1648cm-1 此處是無(wú)規(guī)卷曲的特征吸收峰;45℃下,隨著壓力的升高,酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1647cm-1向高波數(shù)移動(dòng)到1657cm-1,此處是α螺旋的特征吸收峰;55℃下,酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1648cm-1 移動(dòng)到1639cm-1,此處是β折疊的特征吸收峰,隨后又隨著壓力的增大移動(dòng)到1648cm-1。同樣,隨著溫度的不斷升高,酰胺Ⅰ帶的吸收峰也發(fā)生了不同程度的位移。
為了將肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶的差異放大,提高光譜的分辨率,對(duì)其進(jìn)行了二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo),重疊峰和小肩峰被明顯分離,總峰數(shù)在9~12個(gè)之間,符合處理規(guī)則。觀察各種處理的每個(gè)峰帶,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有明顯的變化。波數(shù)出現(xiàn)紅移或者藍(lán)移,或者出現(xiàn)新峰。
表1 超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量(%)變化
處 理 | β折疊/% | 無(wú)規(guī)卷曲/% | a螺旋/% | Β轉(zhuǎn)角/% |
25°C 未處理 200MPa 400MPa 600MPa |
38.58±0.34a 36.27±0.45ab 34.42±0.27b 29.76±0.12c |
15.69±0.09a 17.48±0.13a 17.38±0.24a 22.54±0.47b |
15.85±0.25a 16.93±0.07a 16.86±0.19a 22.16±0.22b |
29.89±0.13a 29.31±0.16a 31.34±0.33a 25.54±0.32b |
35°C 未處理 200MPa 400MPa 600MPa |
39.49±0.59a 38.81±0.31a 35.72±0.29b 28.46±0.23c |
14.41±0.06a 14.33±0.22a 17.30±0.36b 30.64±0.20c |
14.12±0.28a 13.65±0.14a 16.78±0.29a 14.86±0.31a |
31.97±0.55a 33.21±0.39a 30.20±0.12a 25.54±0.32b |
45°C 未處理 200MPa 400MPa 600MPa |
42.47±0.11a 39.41±0.23b 36.35±0.17c 34.87±0.04c |
16.33±0.22a 15.83±0.29a 16.53±0.29a 17.36±0.33a |
14.97±0.51a 15.43±0.35a 16.68±0.19a 16.97±0.59a |
26.23±0.05a 29.33±0.09b 30.44±0.03c 30.79±0.44c |
55°C 未處理 200MPa 400MPa 600MPa |
44.72±0.34a 39.66±0.28b 39.46±0.44b 29.88±0.51c |
19.17±0.19a 14.76±0.03b 15.42±0.55b 24.92±0.39c |
14.76±0.09a 12.95±0.37a 15.59±0.21a 13.31±0.30a |
21.36±0.38a 32.63±0.42b 29.53±0.47c 31.85±0.03d |
注:同列中同一溫度標(biāo)注不同字母者具有極顯著性差異,p<0.01。
曲線(xiàn)擬合結(jié)果如表1所示,未處理肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)主要以β折疊為主,占38.58%,其他三類(lèi)分別為α螺旋15.85%,β轉(zhuǎn)角29.89%和無(wú)規(guī)卷曲15.69%。胡飛華采用傅里葉紅外光譜分析超高壓對(duì)梅魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以β 折疊為主。25℃下,隨著處理壓力的升高,β折疊含量極顯著下降(p<0.01),無(wú)規(guī)卷曲含量極顯著上升(p<0.01)。α螺旋在600MPa 時(shí)極顯著增大(p<0.01),β轉(zhuǎn)角隨著處理壓力的增加逐漸增大,400 MPa 達(dá)到最大值,隨后極顯著降低(p<0.01)。35℃時(shí),β折疊與無(wú)規(guī)卷曲含量變化與25℃相似,α螺旋未發(fā)生明顯變化,β轉(zhuǎn)角也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)。45℃處理下,隨著壓力的增大,β折疊極顯著降低(p<0.01),無(wú)規(guī)卷曲和α螺旋含量緩慢增大,β轉(zhuǎn)角含量極顯著上升(p<0.01),由26.23%增加到30.79%。55℃下,β折疊和α螺旋含量下降,分別由44.72%和14.76%下降到29.88%和13.31%,無(wú)規(guī)卷曲和β轉(zhuǎn)角含量極顯著上升(p<0.01),分別由由19.17%和21.36%上升到24.92%和31.85%。此時(shí),豬肉肌原纖維蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,螺旋結(jié)構(gòu)減少,無(wú)序結(jié)構(gòu)增多,疏水結(jié)合和離子結(jié)合可能由于體積的減小被切斷,分子鏈展開(kāi)。同時(shí),對(duì)比不同溫度處理下,β折疊和α螺旋的含量不難發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高,β折疊含量逐漸升高,α螺旋含量逐漸降低,說(shuō)明加熱促進(jìn)肌原纖維蛋白的α螺旋向β折疊轉(zhuǎn)換。α螺旋結(jié)構(gòu)是通過(guò)分子內(nèi)氫鍵維持的蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列。在加熱條件下其含量降低說(shuō)明加熱導(dǎo)致維持α螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用減弱,促進(jìn)蛋白質(zhì)分子展開(kāi);β折疊是通過(guò)分子間氫鍵維持的蛋白質(zhì)分子間的有序排列,加熱后其含量增加代表蛋白質(zhì)分子間氫鍵作用增強(qiáng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集程度增大。
2.6 相關(guān)性分析
表2 超高壓和熱處理與蛋白質(zhì)相互作用力、蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性
指標(biāo) | 靜電相互作用 | 氫鍵 | 疏水相互作用 | 二硫鍵 | 巰基 | 疏水性 | 羰基值 | β 折疊 | 無(wú)規(guī)卷曲 | α 螺旋 | β 轉(zhuǎn)角 |
溫度 | -0.319 | -0.762** | 0.349 | 0.694** | -0.694** | 0.587** | 0.698** | 0.348 | -0.047 | -0.545* | -0.057 |
壓力 | -0.915** | 0.493** | -0.786** | 0.681** | -0.681** | 0.748** | 0.675** | -0.859** | 0.617* | 0.396 | 0.09 |
靜電相互作用 | 1 | -0.214 | 0.634** | -0.855** | 0.855** | -0.860** | -0.876** | 0.745** | -0.694** | -0.189 | 0.041 |
氫鍵 | 1 | -0.752** | -0.26 | 0.26 | -0.119 | -0.194 | -0.725** | 0.28 | 0.481 | 0.314 | |
疏水相互作用 | 1 | -0.27 | 0.27 | -0.411* | -0.262 | 0.840** | -0.561* | -0.39 | -0.204 | ||
二硫鍵 | 1 | -1.000** | 0.966** | 0.951** | -0.361 | 0.47 | -0.004 | -0.143 | |||
巰基 | 1 | -0.966** | -0.951** | 0.361 | -0.47 | 0.004 | 0.143 | ||||
疏水性 | 1 | 0.902** | -0.406 | 0.443 | 0.064 | -0.087 | |||||
羰基值 | 1 | -0.404 | 0.481 | -0.056 | -0.058 | ||||||
β 折疊 | 1 | -0.748** | -0.392 | -0.107 | |||||||
無(wú)規(guī)卷曲 | 1 | 0.143 | -0.444 | ||||||||
α 螺旋 | 1 | -0.317 | |||||||||
β 轉(zhuǎn)角 | 1 |
注:*顯著相關(guān)(P< 0.05);**極顯著相關(guān)(p<0.01)。
由表2可知,溫度與氫鍵和巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與二硫鍵、疏水性、羰基值呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),與α螺旋呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),說(shuō)明加熱破壞了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),使氫鍵減小,蛋白質(zhì)氧化,促進(jìn)巰基與二硫鍵二者之間的轉(zhuǎn)換,使疏水性上升,同時(shí),破壞了分子內(nèi)的有序排列,使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)程度增加。壓力與氫鍵、二硫鍵、疏水性、羰基值呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),與靜電相互作用、疏水相互作用、巰基、β折疊呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與無(wú)規(guī)卷曲呈顯著正相關(guān)(p<0.05),說(shuō)明與熱處理相反的是壓力可以穩(wěn)定氫鍵,使巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵,疏水性增大,羰基值增加,蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定,靜電相互作用和疏水相互作用在壓力的作用下被削弱,蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)減少,無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。還可以發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)羰基值與靜電相互作用和巰基呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.876 和0.951,與二硫鍵和疏水性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.951和0.902,說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化可以引起聚集和表面疏水性的變化,進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。靜電相互作用力與β折疊呈極顯著正相關(guān)與無(wú)規(guī)卷曲呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),氫鍵與β折疊呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),疏水相互作用力與β折疊呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),與無(wú)規(guī)卷曲呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05),說(shuō)明隨著蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,靜電相互作用和疏水相互作用力被削弱,氫鍵由于蛋白質(zhì)的展開(kāi)聚集和體積減小被加強(qiáng)。
3 結(jié)論
在超高壓結(jié)合熱處理豬肉過(guò)程中,隨著壓力和溫度的升高,肌原纖維蛋白巰基含量極顯著下降(p<0.01),二硫鍵含量極顯著上升(p<0.01),疏水性和羰基值都極顯著增大(p<0.01),高壓結(jié)合熱處理后穩(wěn)定豬肉蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵。豬肉肌原纖維蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中發(fā)生重排,螺旋結(jié)構(gòu)減少,無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。從相關(guān)性分析的結(jié)果看,超高壓結(jié)合熱處理與蛋白質(zhì)相互作用力、蛋白質(zhì)羰基值、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間存在著極顯著的相關(guān)關(guān)系(p<0.01)。同時(shí),蛋白質(zhì)羰基值與靜電相互作用和巰基呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01 ),與二硫鍵和疏水性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化可以引起聚集和表面疏水性的變化,進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。靜電相互作用力和疏水相互作用力與β折疊呈極顯著正相關(guān)與無(wú)規(guī)卷曲呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)(p<0.05),氫鍵與β折疊呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),說(shuō)明隨著蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,靜電相互作用和疏水相互作用力被削弱,氫鍵由于蛋白質(zhì)的展開(kāi)聚集和體積減小被加強(qiáng)。